Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным бюджетным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт жиров" (ВНИИЖиров)

2 ВНЕСЕН Межгосударственным техническим комитетом по стандартизации ТК 238 "Масла растительные и продукты их переработки"

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 апреля 2025 г. N 184-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 июня 2025 г. N 574-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 12228-1-2025 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 мая 2026 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 12228-1:2014 "Определение состава и общего содержания стеролов. Метод газовой хроматографии. Часть 1. Жиры и масла животные и растительные" ("Determination of individual and total sterols contents - Gas chromatographic method - Part 1: Animal and vegetable fats and oils", IDT).

Международный стандарт разработан Подкомитетом SC 11 "Жиры и масла животные и растительные" Технического комитета ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие ему межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

7 Некоторые элементы настоящего стандарта могут быть объектом патентных прав. Международная организация по стандартизации (ISO) не несет ответственности за идентификацию какого-либо или всех патентных прав

Настоящий стандарт устанавливает метод газохроматографического определения содержания и состава стеролов в животных и растительных жирах и маслах. Определение содержания и состава стеролов в оливковом масле и масле из выжимок оливок проводят в соответствии с ISO 12228-2.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты [для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных - последнее издание (включая все изменения)]:

ISO 661, Animal and vegetable fats and oils - Preparation of test sample (Жиры и масла животные и растительные. Приготовление пробы для испытания)

ISO 3696, Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 состав стеролов: Состав индивидуальных стеролов в пробе, начиная с холестерола и заканчивая (см. таблицу 1), определенный в условиях, указанных в настоящем стандарте.

Примечание - Состав выражают в процентах от суммы площадей всех пиков, принятых за 100%.

3.2 общее содержание стеролов: Массовая доля суммы всех индивидуальных стеролов, определенная в соответствии с методом, указанным в настоящем стандарте, начиная с холестерола и заканчивая (см. таблицу 1), деленная на массу испытуемой пробы.

Примечание - Содержание выражают в миллиграммах на килограмм жира.

Испытуемую пробу омыляют раствором гидроксида калия в этаноле при кипячении с обратным холодильником. Неомыляемые вещества отделяют твердофазной экстракцией на колонке с оксидом алюминия. Колонку с оксидом алюминия используют для удержания анионов жирных кислот; стеролы проходят через колонку. Фракцию стеролов отделяют от неомыляемых веществ с помощью тонкослойной хроматографии. Качественный и количественный состав фракции стеролов определяют методом газовой хроматографии, используя холестанол или бетулин в качестве внутреннего стандарта.

Используют только реактивы признанной аналитической степени чистоты, если не указано иное, и воду, соответствующую классу 3 по ISO 3696.

5.1 Гидроксид калия (KOH), раствор в этаноле, с молярной концентрацией c (KOH) приблизительно 0,5 моль/дм³.

3 г гидроксида калия растворяют в 5 см³ воды и доводят объем раствора этанолом (5.3) до 100 см³. Раствор должен быть бесцветным или соломенного цвета.

5.2 Раствор внутреннего стандарта, холестанол или бетулин, раствор в этаноле с объемной долей 1,0 мг/см³ (см. примечание к 5.10).

Примечание - Для гидрогенизированных масел, которые могут содержать холестанол, рекомендуется использовать бетулин (пик 17 в таблице 1).

5.3 Этанол с минимальной объемной долей .

5.4 Оксид алюминия нейтральный, размер частиц от 0,063 до 0,200 мм, класс активности I (содержание воды = 0%).

5.5 Диэтиловый эфир, свежеперегнанный, не содержащий перекисей и осадка.

5.6 Пластины с силикагелем для тонкослойной хроматографии (ТСХ), коммерчески доступные, размеры 20 x 20 см, толщина слоя 0,25 мм.

5.7 Элюирующий растворитель, гексан/диэтиловый эфир. Объемная доля каждого растворителя составляет 50 см³/100 см³.

5.8 Стандартный раствор для тонкослойной хроматографии, объемная доля холестерола/холестанола 1,0 мг/см³ в ацетоне или бетулина - 5,0 мг/см³ в ацетоне.

Примечание 1 - Холестерол и холестанол имеют одинаковое значение Rf (0,35) в ТСХ, тогда как значение Rf для бетулина составляет 0,30 (см. рисунок A.1).

Примечание 2 - Для гидрогенизированных масел, которые могут содержать холестанол, рекомендуется использовать бетулин (пик 17 в таблице 1).

5.9 Реагент для опрыскивания, метанол.

5.10 Силилирующий реактив, приготовленный добавлением 50 мкл 1-метилимидазола к 1 см³ N-метил-N-(триметилсилил)гепта-фторбутирамида (MSHFBA).

Примечание - В продаже имеются готовые реактивы. Другие реактивы для силилирования, например бис-триметилсилил-трифторацетамид с 1% триметилхлорсилана, также доступны и могут применяться, если в качестве внутреннего стандарта используют холестанол. Однако в отношении бетулина принимают специальные меры предосторожности, чтобы гарантировать силилирование обеих гидроксильных групп бетулина. В противном случае бетулин может иметь два пика на хроматограмме.

Используют стандартное лабораторное оборудование и, в частности, следующее.

6.1 Колбы круглодонные вместимостью 25 и 50 см³, со шлифом.

6.2 Холодильник обратный со шлифом для установки в колбу (6.1).

6.3 Колонка стеклянная с пробкой из политетрафторэтилена (ПТФЭ), фильтром из пористого стекла, вместимостью 100 см³, длиной 25 см, внутренним диаметром 1,5 см.

6.4 Испаритель ротационный, снабженный вакуумным насосом и водяной баней, поддерживающей температуру 40 °C.

6.5 Резервуар стеклянный для элюирования с притертой стеклянной крышкой, пригодный для использования пластин размером 20 x 20 см.

6.6 Микрошприц вместимостью 100 мкл.

6.7 Термостат, поддерживающий температуру (105 +/- 3) °C.

6.8 Эксикатор с эффективным осушителем для хранения пластин.

6.9 Виалы реакционные вместимостью от 0,3 до (1,0 - 1,5) см³ с винтовыми крышками и тефлоновым уплотнителем для приготовления производных стеролов.

6.10 Газовый хроматограф для капиллярных колонок с инжектором для ввода проб с делением потока, пламенно-ионизационным детектором и подходящим регистратором.

6.11 Колонка капиллярная, изготовленная из плавленого кварца или стекла, длиной от 25 до 60 м, внутренним диаметром от 0,20 до 0,25 мм, неподвижная фаза SE-54 (или эквивалентная неполярная фаза с температурным пределом не менее 280 °C - 300 °C); толщина пленки приблизительно 0,1 мкм.

Примечание - Лучшее разрешение пиков достигается при толщине пленки 0,1 мкм.

6.12 Микрошприц для газовой хроматографии для введения проб объемом 1 мкл.

6.13 Весы аналитические, позволяющие взвешивать с точностью до 0,001 г и с ценой деления 0,0001 г.

Отбор проб не является предметом метода, приведенного в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора проб приведен в ISO 5555 [1].

Важно, чтобы в лабораторию была доставлена репрезентативная проба. которая не была повреждена или изменена во время транспортирования или хранения.

Готовят пробу для испытания в соответствии с ISO 661.

Готовят суспензию 10 г оксида алюминия (5.4) в 20 см³ этанола (5.3) и выливают взвесь в стеклянную колонку (6.3). Дают оксиду алюминия осесть и растворителю стечь из колонки до тех пор, пока уровень растворителя не достигнет верхнего уровня слоя оксида алюминия.

Взвешивают с точностью до 1 мг приблизительно 250 мг испытуемой пробы в колбе вместимостью 25 см³ (6.1) и продолжают по 8.3.

Для жиров и масел с низким содержанием стеролов (например, менее 2000 мг на килограмм) или по другим причинам массу испытуемой пробы следует увеличить в три раза. Соответственно вносят корректировки для реактивов и используемого оборудования.

К навеске (8.2) добавляют точно 1,00 см³ раствора внутреннего стандарта (5.2). Добавляют 5 см³ спиртового раствора гидроксида калия (5.1) и несколько гранул ("кипелок") для предотвращения выброса содержимого. Вставляют обратный холодильник (6.2) в колбу и поддерживают содержимое в состоянии слабого кипения в течение 15 мин. Прекращают нагревание. Немедленно добавляют к горячему содержимому колбы 5 см³ этанола (5.3) и перемешивают или встряхивают до гомогенизации.

Пипеткой вносят 5 см³ этого раствора в подготовленную колонку с оксидом алюминия (8.1). Элюат собирают в круглодонную колбу вместимостью 50 см³ (6.1) и дают стекать до тех пор, пока уровень растворителя не достигнет верхнего уровня слоя оксида алюминия. Неомыляемые вещества элюируют сначала 5 см³ этанола (5.3), а затем 30 см³ диэтилового эфира (5.5) со скоростью потока примерно 2 см³/мин. Растворители из колбы удаляют с помощью ротационного испарителя (6.4).

Неомыляемые вещества, полученные по 8.3, растворяют в небольшом количестве (приблизительно 0,5 см³) диэтилового эфира (5.5). Раствор наносят на пластинку линией на расстоянии 2 см от нижнего края пластины ТСХ (5.6) с помощью микрошприца (6.6). Оставляют зазор не менее 3 см от каждого бокового края пластины. Наносят 5 мкл стандартного раствора ТСХ (5.8) в виде пятна на расстоянии 1,5 см от края пластины. В резервуар для элюирования (6.5) наливают примерно 100 см³ элюирующего растворителя (5.7). Пластину помещают в резервуар и элюируют до тех пор, пока растворитель не достигнет ее верхнего края. Пластину вынимают из резервуара и дают растворителю испариться в вытяжном шкафу.

Примечание - Количественный перенос материала (8.3) на пластину ТСХ на этом этапе не требуется. Допускается использовать автоматическое устройство для нанесения полос. Насыщения камеры не требуется.

Опрыскивают пластины метанолом (5.9) до тех пор, пока зоны стерола (и бетулина) не станут белыми на полупрозрачном (более темном) фоне. Холестанол является частью зоны (см. рисунок A.1). Размечают зоны на высоте пятен стандартного раствора на 2 мм выше и на 4 мм ниже видимых зон (см. рисунок A.1). Полностью соскребают эту часть слоя с помощью шпателя и количественно собирают силикагель в небольшой стакан.

Примечание 1 - Более широкое поле у нижнего края видимых зон (4 мм против 2 мм у верхнего края) - это мера предосторожности, чтобы избежать частичной потери бетулина на этом этапе. В подсолнечном масле можно обнаружить три полосы (, и бетулин).

Примечание 2 - Бетулин, если его используют в качестве внутреннего стандарта, появляется немного ниже зоны стеролов (см. рисунок A.1).

К собранному силикагелю добавляют 0,5 см³ этанола. Силикагель экстрагируют в стакане трижды порциями по 5 см³ диэтилового эфира (5.5) и фильтруют в колбу (6.1). Объединенные эфирные экстракты упаривают на ротационном испарителе (6.4) примерно до 1 см³ и переносят оставшийся раствор в реакционную виалу (6.9). Выдувают растворитель из виалы потоком азота.

Добавляют 100 мкл реактива для силилирования (5.10) в реакционную виалу (6.9), содержащую выделенные стеролы. Закрывают виалу и нагревают ее в течение 15 мин в термостате при температуре (105 +/- 3) °C. Дают виале остыть до комнатной температуры и вводят раствор непосредственно в газовый хроматограф (6.10).

Оптимизируют температурную программу и скорость потока газа-носителя так, чтобы полученные хроматограммы были подобны хроматограммам на рисунках A.2 - A.7. Проверяют разделение с помощью фракций силилированных стеролов, полученных из известных масел, как показано на рисунках A.2 - A.7.

Примечание 1 - Следующие параметры были протестированы и признаны подходящими (см. хроматограммы в приложении A): колонка для газовой хроматографии: SE-54, длина 50 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,10 мкм; газ-носитель H₂, скорость потока газа-носителя 36 см/с, разделение 1:20, детектор/инжектор 320 °C, температурный режим от 245 °C до 265 °C со скоростью 5 °C/мин, изотерма при температуре 265 °C в течение 40 мин; объем вводимой пробы - 1 мкл. Допускается использовать капиллярные колонки эквивалентного качества.

Примечание 2 - Для проверки времени удерживания допускается использовать стандартный раствор, содержащий холестерол, кампестерол, стигмастерол и ситостерол. Используют холостой анализ для проверки на возможное загрязнение (например, холестеролом) от растворителей, стеклянных стенок, фильтров, отпечатков пальцев и т.д.

Для идентификации стеролов, присутствующих в испытуемой пробе, определяют относительное время удерживания (RRT) путем деления времени удерживания (RT) рассматриваемого стерола на RT холестерола и/или бетулина. В таблице 1 приведены RRT различных стеролов, вычисленные относительно холестерола (RRT_C) и бетулина (RRT_B), с использованием стационарной фазы SE-54.

Примечание - Значения RRT в таблице 1 (определенные в условиях, указанных в примечании 1 к 8.7) приведены только как вспомогательные для идентификации индивидуальных стеролов и для иллюстрации последовательности элюирования (см. также рисунок A.1). Фактическое значение RRT может несколько отличаться от RRT, приведенного в таблице 1, поскольку RRT зависит от условий проведения испытания (тип и длина колонки для газожидкостной хроматографии, температурный режим и качество стационарной фазы).

Массовую долю w_i индивидуального стерола i, г/100 г (%), вычисляют по формуле

где A_i - площадь пика стерола i;

- сумма площадей пиков всех стеролов (пики 1, 3 - 16 или 1 - 16, если используют бетулин).

Для целей данного метода предполагается, что коэффициенты отклика всех стеролов и бетулина равны.

Примечание - В ходе нескольких испытаний силилированные стеролы и силилированный бетулин в равных количествах дали одинаковый отклик детектора при использовании пламенно-ионизационного детектора в этих условиях.

Общее содержание стеролов w, мг/кг жира, вычисляют по формуле

где m_IS - масса внутреннего стандарта (холестанола), внесенного в пробу, мг;

- сумма площадей пиков всех стеролов (пики 1, 3 - 16 или 1 - 16, если используют бетулин);

A_IS - площадь пика внутреннего стандарта;

m - масса навески, г.

Для вычисления общего содержания стеролов рассматривают все пики стеролов, начиная с холестерола и заканчивая (пик 16), но без эритродиола и уваола (пики X и Y).

Подробная информация о межлабораторных испытаниях для оценки прецизионности метода приведена в приложении B. Значения, полученные в результате этих межлабораторных испытаний, могут быть неприменимы к диапазонам концентраций и матрицам, отличающимся от приведенных.

Предел повторяемости r - это число, меньшее или равное значению абсолютного расхождения между двумя результатами испытаний, полученными в условиях повторяемости, с вероятностью 95%.

Условия повторяемости - это условия, при которых независимые результаты испытаний получены одним и тем же методом на идентичных испытуемых объектах в одной и той же лаборатории одним и тем же оператором с использованием одного и того же оборудования в течение коротких промежутков времени.

Предел воспроизводимости R - это число, меньшее или равное значению абсолютного расхождения между двумя результатами испытаний, полученными в условиях воспроизводимости, с вероятностью 95%.

Условия воспроизводимости - это условия, при которых независимые результаты испытаний получены одним и тем же методом на идентичных испытуемых объектах испытаний в разных лабораториях разными операторами, использующими разное оборудование в течение коротких промежутков времени.

Протокол испытаний должен содержать следующее:

a) всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;

b) использованный метод отбора проб, если он известен;

c) использованный метод испытаний со ссылкой на настоящий стандарт;

d) все рабочие детали, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как необязательные, вместе с подробностями любых случаев, которые могли повлиять на результат(ы) испытания;

e) полученные результаты испытаний или окончательный результат, если соблюдены условия повторяемости.

Примечание - Зоны проявляются белыми на прозрачном фоне. Заштрихованная область соскоблена; следует обратить внимание на более широкое поле внизу (4 мм против 2 мм вверху). Значения Rf полос: бетулин - 0,30; - 0,33; - 0,35; метилстеролы - 0,45; тритерпены - 0,53.

Примечание - Идентификацию номеров пиков проводят в соответствии с таблицей 1. Условия - как указано в примечании 1 к 8.7.

Примечание - Идентификацию номеров пиков проводят в соответствии с таблицей 1. Условия - как указано в примечании 1 к 8.7.

Примечание - Идентификацию номеров пиков проводят в соответствии с таблицей 1. Условия - как указано в примечании 1 к 8.7.

Примечание - Идентификацию номеров пиков проводят в соответствии с таблицей 1. Условия - как указано в примечании 1 к 8.7.

Примечание - Идентификацию номеров пиков проводят в соответствии с таблицей 1. Условия - как указано в примечании 1 к 8.7.

Примечание - Идентификацию номеров пиков проводят в соответствии с таблицей 1. Условия - как указано в примечании 1 к 8.7.

Прецизионность метода была подтверждена двумя международными межлабораторными испытаниями, организованными Германией в 2011/2012 и 1996/1997 годах. Статистическую оценку проводили в соответствии с [2] и [3].

Обозначение пробы:

A - рафинированное кукурузное масло;

B - рафинированное подсолнечное масло;

C - рафинированное сафлоровое масло;

D - рафинированное рапсовое масло;

E - рафинированное дезодорированное отбеленное пальмовое масло (RDB);

F - сливочное масло.

--------------------------------

<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".