Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным бюджетным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт жиров" (ВНИИЖиров) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Межгосударственным техническим комитетом по стандартизации МТК 238 "Масла растительные и продукты их переработки"

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 31 июля 2024 г. N 175-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 1 августа 2024 г. N 1013-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 9936-2024 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 апреля 2025 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 9936:2016 "Жиры и масла животные и растительные. Определение содержания токоферолов и токотриенолов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" ("Animal and vegetable fats and oils - Determination of tocopherol and tocotrienol contents by high-performance liquid chromatography", IDT).

Международный стандарт разработан Подкомитетом SC 11 "Жиры и масла животные и растительные" Технического комитета ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

7 Некоторые элементы настоящего стандарта могут быть объектом патентных прав. Международная организация по стандартизации (ISO) не несет ответственность за идентификацию каких-либо или всех патентных прав

Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания свободных , , и и токотриенолов (совместно называемые токолами) в животных и растительных жирах и маслах (далее - жиры) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Для продуктов, содержащих сложные эфиры токоферола или токотриенола, необходимо проводить предварительное омыление.

Молоко и молочные продукты (или жиры, выделенные из молока и молочных продуктов) не относятся к области применения настоящего стандарта

Примечание - Пригодный метод, включающий процедуру холодного омыления, приведен в приложении B в качестве справочного.

В настоящем стандарте использована нормативная ссылка на следующий стандарт [для датированной ссылки применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированной - последнее издание (включая все изменения)]:

ISO 661, Animal and vegetable fats and oils - Preparation of test sample (Жиры и масла животные и растительные. Приготовление пробы для испытания)

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

3.1 содержание токолов (tocol content): Массовая доля индивидуальных токолов, определяемая методом, установленным настоящим стандартом.

Примечание - Содержание выражают в миллиграммах на килограмм с округлением результата до целого числа.

Испытуемую пробу растворяют в н-гептане, и индивидуальные токолы разделяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Содержание каждого токола рассчитывают с использованием калибровочных коэффициентов, определяемых по калибровочным растворам.

Следует использовать только реактивы квалификации "для ВЭЖХ" или эквивалентной чистоты.

Если стандарты токоферолов недоступны, для идентификации , , и можно использовать смесь масла зародышей пшеницы и соевого масла.

Если стандарты токотриенолов недоступны, для идентификации и можно использовать пальмовое масло. Полученные хроматограммы могут способствовать идентификации пиков на хроматограммах испытуемых проб, в этом случае следует использовать калибровочные коэффициенты для соответствующих токоферолов.

Примечание - Стандарты , , и и токотриенола могут быть получены от Merck <1>; может быть получен от различных поставщиков. Стандарты токотриенола доступны от Sigma Aldrich <2>. Чистота некоторых коммерчески доступных стандартов токоферола может варьироваться от 85% до 100%. Таким образом, важно определить концентрацию приготовленных калибровочных растворов методом УФ-спектрометрии (9.1.1).

--------------------------------

<1> Набор Merck Tocopherol 613424 доступен от Calbiochem (www.calbiochem.com). Он содержит по одному флакону, по 50 мг каждый , , и с чистотой 95% по данным ВЭЖХ (для каждого компонента). Набор Merck Tocotrienol 613432 также доступен от Calbiochem. Он содержит по одному флакону по 50 мг каждый , , и с чистотой 95% по данным ВЭЖХ (75% для ). Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает одобрения названных продуктов со стороны ISO. Могут быть использованы эквивалентные продукты, если они обеспечивают одинаковые результаты.

<2> Токотриенолы доступны от Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com) и от Chromadex (www.chromadex.com) с чистотой от 65% до 98%. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает одобрения названных продуктов со стороны ISO. Могут быть использованы эквивалентные продукты, если они обеспечивают одинаковые результаты.

5.2 Тетрагидрофуран, отфильтрованный через нейлоновый фильтр для ВЭЖХ (0,45 мкм).

5.3 н-Гептан, отфильтрованный через нейлоновый фильтр для ВЭЖХ (0,45 мкм).

5.4 Подвижная фаза ВЭЖХ.

Следует использовать любую подходящую смесь растворителей, которая, как подтвердилось, обеспечивает хроматографическое разрешение пиков не хуже, чем данные, которые приведены в таблице 2 (относительное время удерживания токоферолов и токотриенолов) и в приложении A (хроматограммы смеси растительных масел), (см. таблицу C.3).

Хорошее разделение и может быть достигнуто при использовании смеси 5% (по объему) метил-трет-бутилового эфира +95% (по объему) н-гептана и диоловой колонки.

Подходящую подвижную фазу, 3,85% (объемная доля) раствора тетрагидрофурана в н-гептане готовят следующим образом. Используя мерный цилиндр вместимостью 1000 см³ (6.5), наливают 1000 см³ н-гептана (5.3) в 2-литровую склянку. Добавляют дважды по 20 см³ тетрагидрофурана (5.2) с помощью мерной пипетки на 20 см³ (6.6). Гомогенизируют подвижную фазу с помощью ультразвуковой ванны (6.8) в течение 15 мин.

5.5 Метанол.

Используется стандартное лабораторное оборудование, в частности, следующее.

6.1 Система ВЭЖХ, состоящая из насоса высокого давления, устройства для ввода пробы, термостата колонки, настроенного на 25 °C (опционально), детектора флуоресценции с установленной длиной волны возбуждения 295 нм и длиной волны испускания 330 нм, а также регистрирующего интегратора.

Если флуоресцентный детектор недоступен, можно использовать ультрафиолетовый (УФ) детектор, но это не рекомендуется. Однако, если используется УФ-детектор, длина волны должна быть установлена на 292 нм.

6.2 Аналитическая колонка ВЭЖХ, возможны два типа колонки:

- 250 мм x 4 мм, заполненные микрочастицами диола со средним размером частиц около 5 мкм, или

- 250 мм x 4,6 мм, заполненные микрочастицами диоксида кремния со средним размером частиц около 5 мкм.

Примечания

1 Подходящим коммерчески доступным наполнителем диоловой колонки с диоксидом кремния является 5 мкм LiChrospher 100 Diol; подходящими материалами для наполнения колонки с диоксидом кремния, доступными в продаже, являются LiChrosorb SI 60 с размером частиц 5 мкм и Kromasil 100 <3>. Если в пробе ожидается наличие , предпочтительнее использовать диоловую колонку с диоксидом кремния, так как при использовании колонки с диоксидом кремния и элюируются совместно.

--------------------------------

<3> Эти типы колонок являются примерами подходящих продуктов, имеющихся в продаже. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает продвижения этих продуктов.

2 Длина и диаметр колонки могут варьироваться в зависимости от используемого метода ВЭЖХ.

3 Оба типа колонок были использованы для оценки точности (приложение C).

6.3 УФ-спектрометр, пригодный для абсолютного измерения абсорбции при точно определенных длинах волн, с кюветой с длиной оптического пути 10 мм.

6.4 Испаритель ротационный.

6.5 Цилиндр мерный вместимостью 1000 см³.

6.6 Пипетки мерные вместимостью 5; 10; 20 см³.

6.7 Колбы мерные вместимостью 50; 25 см³.

6.8 Баня ультразвуковая.

В лабораторию следует направлять представительную пробу. Важно, чтобы проба не была повреждена или изменена во время транспортирования или хранения.

Отбор проб не является частью метода, установленного настоящим стандартом. Рекомендуемый метод отбора проб приведен в ISO 5555.

В случае жидких лабораторных проб пробу для испытания готовят путем гомогенизации, как описано в ISO 661, за исключением случаев, когда следует избегать фильтрации.

В случае твердых проб представительную часть (т.е. не менее 10% лабораторной пробы по массе) переносят в стеклянный стакан и тщательно гомогенизируют путем расплавления при осторожном перемешивании на водяной бане при температуре не выше 40 °C.

Приготовление проб для испытания следует проводить, насколько это практически возможно, при слабом освещении и во всех случаях вдали от прямого солнечного света.

Готовят исходный раствор каждого токола, взвешивая (10 +/- 1) мг стандарта (5.1) в мерной колбе вместимостью 50 см³ (6.7) и разбавляя до метки н-гептаном (5.3).

Пипеткой (6.6) переносят 5 см³ этого раствора в круглодонную колбу из темного стекла и отгоняют весь н-гептан на ротационном испарителе (6.4) под вакуумом при температуре не выше 40 °C. Сразу же после удаления всего растворителя сбрасывают вакуум азотом и отсоединяют колбу от испарителя. Пипеткой (6.6) приливают в колбу 10 см³ метанола (5.5) и взбалтывают до растворения остатка. Измеряют максимальное поглощение этого раствора в диапазоне длин волн от 270 до 310 нм (см. соответствующую длину волны в таблице 1), используя УФ-спектрометр (6.3), в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Измеренная абсорбция должна быть между 0,2 и 0,8. Рассчитывают концентрацию (в микрограммах на кубический сантиметр), разделив значение абсорбции на соответствующий коэффициент, указанный в таблице 1.

Готовят подходящий стандартный раствор в соответствии с чувствительностью используемого флуоресцентного детектора.

В качестве примера приведено приготовление рабочего раствора следующим способом: смешивают соответствующие объемы, например 1 см³, исходных калибровочных растворов (см. 9.1.1) для получения смешанного стандартного раствора токола и разбавляют н-гептаном, чтобы получить раствор с концентрацией каждого стандарта от 1 до 5 мкг/см³.

Стандартный раствор следует готовить каждый рабочий день.

Все растворы защищают от света и хранят при температуре от 0 °C до 4 °C.

Исходные стандартные растворы могут храниться в холодильнике в посуде из темного стекла до одной недели. Колбы можно обернуть алюминиевой фольгой.

Примечание - Если используется УФ-детектор, может потребоваться более концентрированный раствор.

9.2.1 Если колонка (6.2) новая или история ее использования неизвестна, или если по какой-либо другой причине ее необходимо подготовить, то колонку промывают и кондиционируют в течение 10 минут метанолом, потом дихлорметаном, а затем н-гептаном при скорости потока около 1 см³/мин.

Прокачивают подвижную фазу ВЭЖХ (5.4) через колонку со скоростью потока 1 см³/мин в течение не менее 30 мин.

9.2.2 В колонку вводят 10 или 20 мкл (в зависимости от чувствительности детектора) стандартного раствора (см. 9.1.2) и при необходимости регулируют содержание тетрагидрофурана в подвижной фазе и скорость потока для достижения следующих условий:

a) время удерживания от 8 до 12 минут;

b) коэффициент разрешения, RF, для разделения и не менее 1,0; то есть почти базовое разделение, где RF рассчитывают по формуле

где d_r(I) - расстояние удерживания ;

d_r(II) - расстояние удерживания ;

b(I) - ширина основания пика ;

b(II) - ширина основания пика .

9.2.3 Выбирают оптимальные настройки для системы обнаружения и интеграции. Вводят 10 или 20 мкл стандартного раствора (см. 9.1.2). Повторяют введение, чтобы убедиться, что получены воспроизводимые хроматограммы.

В зависимости от концентрации токола (см. 9.1.2) взвешивают с точностью до 1 мг (0,25 +/- 0,1) г пробы для испытания (см. раздел 8) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 25 см³. Добавляют некоторое количество н-гептана (5.3), взбалтывая растворяют навеску и разбавляют до метки тем же растворителем. Отфильтровывают раствор через нейлоновый фильтр для ВЭЖХ 0,45 мкм, если раствор непрозрачен.

Важно, чтобы испытуемые растворы были защищены от света перед анализом и проанализированы в день приготовления.

Примечание - Возможно, потребуется приготовить более концентрированный раствор или дополнительно разбавить раствор перед хроматографированием.

9.4.1 В колонку вводят 10 или 20 мкл стандартного раствора (см. 9.1.2) (в зависимости от чувствительности детектора) и записывают площади пиков.

9.4.2 Вводят 10 или 20 мкл (в соответствии с чувствительностью детектора) испытуемого раствора (см. 9.3) в колонку и определяют присутствующие токолы по калибровочным хроматограммам. Записывают площади пиков. Повторяют введение испытуемого раствора и измерение. За результат принимают среднее значение двух измерений.

Вводят еще 10 или 20 мкл (в зависимости от чувствительности детектора) стандартного раствора (см. 9.1.2) и записывают площади пиков.

Относительные значения времени удерживания, приведенные в таблице 2, считаются типичными.

Содержание w в пробе, выраженное в миллиграммах на килограмм (мг/кг), рассчитывают по формуле

где - концентрация в стандартном растворе (9.1.2), мкг/см³;

- среднее значение площадей пиков, полученных для стандарта ;

- среднее значение площадей пиков, полученных для в испытуемой пробе;

m - масса пробы (9.3), г;

V - объем приготовленного испытуемого раствора, равный 25 см³.

Рассчитывают содержание остальных токолов в испытуемой пробе таким же образом, используя данные, полученные для соответствующего стандарта.

Если единственным доступным стандартом является , соотносят все токоферолы с этим стандартом, но четко указывают это при представлении результатов. Если используется УФ-детектирование, также соотносят все токоферолы со стандартом , но корректируют площади пиков по , используя коэффициенты, приведенные в 9.1.1.

Примечание - Интенсивность флуоресценции токотриенолов такая же, как и у соответствующих токоферолов, и УФ-поглощение аналогично.

Содержание выражают в миллиграммах на килограмм с округлением результата до целого числа.

Подробная информация о межлабораторных испытаниях точности метода приведена в приложении C. Значения, полученные в результате этих испытаний, могут быть неприменимы к диапазонам концентраций и матрицам, отличающимся от приведенных.

Абсолютное расхождение между двумя независимыми единичными результатами испытаний, полученными с использованием одного и того же метода на идентичном испытуемом материале в одной и той же лаборатории одним и тем же оператором с использованием одного и того же оборудования в короткий промежуток времени не должно более чем в 5% случаев превышать значения r, приведенные в таблице 3.

Абсолютное расхождение между двумя отдельными результатами испытаний, полученными одним и тем же методом на идентичном испытуемом материале в разных лабораториях разными операторами на различном оборудовании не должно более чем в 5% случаев превышать значения R, приведенные в таблице 3.

Протокол испытаний должен содержать следующее:

a) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

b) используемый метод отбора проб, если он известен;

c) используемый метод испытаний со ссылкой на настоящий стандарт;

d) все подробности процедуры, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как необязательные, а также данные о любых инцидентах, которые могли повлиять на результат(ы) испытания;

e) полученные результаты испытаний;

f) окончательный результат, если соблюдены условия повторяемости.

1 - ;

2 - ;

3 - ;

4 - ;

5 - ;

6 - ;

7 - ;

8 - 

Подвижная фаза: 3,85% (объемная доля) ТГФ (тетрагидрофуран) в н-гептане.

Скорость потока: 1 см³/мин.

Детектор: флуоресцентный

Примечание - На хроматограммах, показанных выше, на оси x указано время в минутах, на оси y - количество.

При анализе переработанных продуктов, содержащих добавленные эфиры токоферола или токотриенола, перед хроматографированием следует провести процедуру холодного омыления. Целесообразно одновременно анализировать пробы, содержащие известные количества сложных эфиров.

Следует использовать реактивы только аналитической степени чистоты.

B.2.1 Этанол, w = 94 г/100 г - 96 г/100 г.

B.2.2 Этанол абсолютный, w >= 99,7 г/100 г.

B.2.3 Пирогаллол.

B.2.4 Гидроокись калия, водный раствор, w = 60 г/100 г.

B.2.5 Диэтиловый эфир, свободный от перекисей, содержащий 0,1% пирогаллола.

B.2.6 Соляная кислота, c(HCl) = 0,01 моль/л.

B.2.7 Сульфат натрия безводный.

B.2.8 Вода, отвечающая требованиям 3-го класса по ISO 3696.

Точно взвешивают около 2 г хорошо перемешанной пробы в плоскодонной колбе вместимостью 100 см³ и тщательно диспергируют расплавленную пробу примерно в 8 см³ этанола (B.2.1) путем осторожного перемешивания. Добавляют 100 мг пирогаллола (B.2.3) и перемешивают до растворения.

Продувают колбу азотом, добавляют 4 см³ раствора гидроокиси калия (B.2.4), повторно продувают колбу азотом и закрывают стеклянной пробкой. Помещают колбу на водяную баню с температурой 26 °C и энергично встряхивают в течение 10 мин или до завершения омыления. Все операции выполняют при отсутствии прямых солнечных лучей, используя посуду из темного стекла или закрывая ее алюминиевой фольгой.

В колбу добавляют 50 см³ воды (B.2.8) и количественно переносят содержимое в делительную воронку вместимостью 250 см³. Колбу промывают 50 см³ диэтилового эфира (B.2.5) и переносят промывную жидкость в воронку. Энергично встряхивают делительную воронку в течение 1 мин, время от времени сбрасывая давление. Дают слоям разделиться и сливают нижний водный слой. Водный слой экстрагируют еще четыре раза порциями по 30 см³ диэтилового эфира и объединяют эфирные экстракты.

Объединенные экстракты диэтилового эфира промывают 50 см³ воды (осторожно встряхивая, чтобы избежать образования эмульсии), а затем 30 см³ разбавленной соляной кислоты (B.2.6). Добавляют около 3 г безводного сульфата натрия (B.2.7) при осторожном перемешивании для поглощения воды. Фильтруют эфирные экстракты через бумагу для разделения фаз и собирают фильтрат в круглодонную колбу из темного стекла для ротационного испарителя. Отгоняют эфир при пониженном давлении при температуре не выше 40 °C. Если в колбе остается жидкий остаток, добавляют этанол (B.2.2) и выпаривают досуха.

Стенки колбы обмывают н-гептаном (5.3), содержимое количественно переносят в мерную колбу с одной меткой вместимостью 50 см³ и доводят до метки н-гептаном. Выполняют соответствующее разведение приготовленного испытуемого раствора (как описано в 9.3) и переходят к 9.4.

Точность метода установлена международными межлабораторными испытаниями, организованными в 2003 г. Институтом исследований липидов Федерального научного центра питания и пищевых продуктов (Мюнстер, Германия) и проведенных в соответствии с ISO 5725-1 и ISO 5725-2. В этом испытании участвовали 12 лабораторий из четырех стран (одна из Венгрии, одна из Канады, четыре из Франции, шесть из Германии), и были исследованы пробы восьми различных типов жира (см. таблицу C.1). Статистическая сводка результатов приведена в таблице C.2.

Различные типы подвижных фаз для ВЭЖХ, используемые участниками этого испытания, перечислены в таблице C.3. В то время как шесть участников использовали колонку с силикагелем, шесть участников также использовали диоловую колонку. Следовательно, статистические результаты, приведенные в таблице B.2, действительны для обоих типов колонок.